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Original Article

Administrações Orais do Látex da Hancornia speciosa Gomes não aumentam a neoformação óssea*

Oral Administrations of Hancornia speciosa Gomes Latex Do Not Increase Bone Neoformation*

Francielly Andressa Felipetti1, Rafaela Mariano Bereta2, Sônia Maria Stefano Piedade3, Pedro Duarte Novaes1

DOI: 10.1055/s-0039-1697019


 

RESUMO:

OBJETIVO Este trabalho objetivou avaliar o efeito sistêmico do látex de H. speciosas obre a neoformação óssea.
MÉTODOS Para isso, o látex foi coletado e diluído a 3% e a 50%. Um total de 28 ratos Wistar foi submetido a cirurgia para a criação de um defeito de 5 mm de diâmetro no osso parietal. Esse experimento foi conduzido em dois períodos distintos: 1 e 2. Para cada período, os ratos foram divididos em 3 grupos: Grupo Controle, Grupo Látex3 e Grupo Látex50 que receberam, respectivamente, administrações diárias de 0,5 mL de água destilada, látex a 3% e látex a 50% por gavagem, via oral. Os ratos dos períodos 1 e 2 foram eutanasiados, respectivamente, 15 e 30 dias após a cirurgia e a calvária foi coletada. Os resultados foram analisados utilizando os testes ANOVA e Tukey; o nível de significância estabelecido foi 0,05.
RESULTADOS Mostramos que, em cada período analisado, os grupos experimentais tiveram a mesma quantidade de osso neoformado no defeito da calvária.
CONCLUSÃO Portanto, concluímos que administrações diárias e orais do látex de H. speciosa a 3% e a 50% durante um período de 15 e 30 dias não contribui para o aumento da área do osso neoformado no defeito da calvária.

Palavras-chave:
apocynaceae; hematoxilina; histologia; látex; osso e ossos; terapias complementares.

ABSTRACT:

OBJECTIVE The present work aimed to evaluate the systemic effect of H. speciosa latex on bone neoformation.
METHODS For this, the latex was collected and diluted to 3% and 50%. A total of 28 Wistar rats were submitted to surgery to create a 5 mm diameter defect in the parietal bone. This experiment was conducted in 2 different periods: 1 and 2. For each period, the rats were divided into 3 groups: Control Group, Latex3 Group, and Latex50 Group, which received, respectively, daily administrations of 0.5 mL of distilled water, latex to 3% and latex to 50% by gavage, orally. The rats of periods 1 and 2 were euthanized, respectively, 15 and 30 days after the surgery, and the calvaria was collected. The results were analyzed using the ANOVA and Tukey tests; the significance level was 0.05.
RESULTS We show that, in each analyzed period, the experimental groups had the same amount of newly formed bone in the calvaria defect.
CONCLUSION We conclude that daily and oral administrations of H. speciosa latex to 3% and to 50% over a period of 15 and 30 days does not contribute to the increase of the area of the newly formed bone in the calvaria defect.

Keywords:
apocynaceae; hematoxylin; histology; latex; bone and bones; complementary therapies.

FIGURAS

Citação: Felipetti FA, Bereta RM, Piedade SMS, Novaes PD. Administrações Orais do Látex da Hancornia speciosa Gomes não aumentam a neoformação óssea*. 54(6):692. doi:10.1055/s-0039-1697019
Nota: * Trabalho feito no Departamento de Morfologia, Faculdade de Odontologia de Piracicaba (FOP), Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Piracicaba, SP, Brasil.
Recebido: June 04 2018; Aceito: August 08 2018
 

INTRODUÇÃO

O osso é um tecido conjuntivo mineralizado altamente dinâmico. As principais células do osso, como osteoblastos, osteoclastos e osteócitos, são essenciais para sua remodelação.1,2 Nos estágios iniciais da produção óssea, os osteoblastos depositam a matriz orgânica, liberam vesículas com estoque de cálcio (Ca) e induzem a degradação do pirofosfato, liberando íons de fosfato.2-4 Fosfato e Ca formam cristais de hidroxiapatita e mineralizam a matriz óssea, formando o novo osso.1 Através deste processo de remodelação óssea, o osso pode se regenerar espontaneamente após o estabelecimento de fraturas, lesões ou defeitos.5 No entanto, a regeneração fisiológica é incapaz de restaurar a integridade óssea em defeitos ósseos extensos, nos quais o processo de reparo deve ser apoiado por algumas terapias complementares.6,7

O látex obtido do tronco da Hevea brasiliensis (uma árvore nativa brasileira conhecida como Seringueira) pode ser um biomaterial inovador para reparo ósseo. Alguns experimentos que foram realizados com este produto incluem a reparação óssea de cavidades dentárias em ratos,8 regeneração guiada de calvária de coelhos,6 a osseointegração de implantes dentários em cães,9 e reparo ósseo de um defeito crítico da calvária de ratos.10,11

O látex extraído do tronco de Hancornia speciosa Gomes (outra árvore nativa brasileira conhecida como Mangabeira, pertencente à família Apocynaceae) também demonstrou potencial de reparo ósseo. O grupo de pesquisa da Faculdade de Odontologia de Piracicaba (FOP) da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), demonstrou que a aplicação tópica de látex de H. speciosa no defeito da calota craniana de ratos Wistar aumentou a área do osso neoformado nas bordas do defeito.12

Algumas comunidades localizadas no nordeste do Brasil produziram um suco leitoso chamado “leite da mangaba” a partir do látex do tronco da H. speciosa. Levantamentos etnobotânicos confirmaram o uso desse suco lácteo para tratamento terapêutico de fraturas ósseas.13 No entanto, até o momento, nenhum estudo foi realizado para confirmar esse efeito.

Em resumo, esses achados nos motivaram a investigar o potencial terapêutico do látex de H. speciosa. Por isso, este estudo relata o efeito sistêmico do látex de H. speciosa na neoformação óssea em ratos Wistar.

 

MATERIAIS E MÉTODOS

Coleta e Análise de Látex

O látex da H. speciosa foi coletado na cidade de Mata de São João, Bahia, Brasil (12º27'42'S 37º56'38'O 69NE) no verão. Uma amostra deste foi depositada na Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ) da Universidade de São Paulo (USP) e recebeu o número ESA 121.402. Após perfurar ∼10 troncos de árvore, 250 mL do látex que pingou foram coletados em um recipiente esterilizado e misturados com água destilada para obter uma solução de látex a 3% e outra a 50%. As soluções foram armazenadas em seringas, protegidas da luz e estocadas a 4ºC.

Animais

Foram utilizados 28 ratos Wistar (peso corporal médio de 390 g; idade de 10 semanas). Os ratos foram alojados em gaiolas individuais sob condições controladas de temperatura e luz (ciclo claro/escuro de 12/12 h). Todos os animais receberam ração e água ad libitum. Antes da cirurgia, os ratos foram anestesiados com injeção intraperitoneal de 80 mg/Kg de Ketamina (Dopalen, SespoIndústria e Comércio Ltda., Paulínia, SP) e 8 mg/Kg de Xilazina (Rompun, Bayer SA, São Paulo, SP, Brasil). A cirurgia consistiu na criação de defeito crítico no osso parietal esquerdo da calvária (diâmetro de 5 mm) usando broca trefina montada em motor odontológico de baixa rotação. Após a cirurgia, os ratos foram administrados por via intramuscular com 2 mg/mL de cloridrato de tramadol (Tramal, Grunenthal do Brasil Pharmaceutical Ltda, São Paulo, SP, Brasil) e repousaram por 24 horas. Esse experimento foi conduzido em 2 períodos distintos: 1 e 2. Para o período 1, os ratos foram divididos em 3 grupos: Grupo Controle 1 (C1, n = 4 ), Grupo Látex 31 (L31, n = 4) e Grupo Látex 501 (L501, n = 5) que receberam, respectivamente, administrações diárias de 0,5 mL de água destilada, látex a 3% e látex a 50% por gavagem, via oral, durante 15 dias. Para o período 2, os ratos foram divididos em 3 grupos: Grupo Controle 2 (C2, n = 5 ), Grupo Látex 32 (L32, n = 5) e Grupo Látex 502 (L502, n = 5) que receberam, respectivamente, administrações diárias de 0,5 mL de água destilada, látex a 3% e látex a 50% por gavagem, via oral, durante 30 dias. Os ratos dos períodos 1 e 2 foram eutanasiados, respectivamente, 15 dias e 30 dias após a cirurgia. Após a eutanásia, a calvária foi coletada para análise. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Uso de Animais (CEUA) com o número de protocolo 3427-1.

Análise Histológica

Clivagem das Amostras e Processamento Histológico

A calvária foi fixada em solução de formol e submetida ao processamento histológico convencional.14 Primeiro, a calvária foi seccionada transversalmente e apenas a porção óssea foi obtida. Posteriormente, a calvária foi descalcificada com solução de PLANK, por 1 semana com 2 trocas diárias. Após a descalcificação, a calvária foi clivada e apenas a região do defeito ósseo foi preservada para posterior processamento. Em seguida, o defeito ósseo da calvária foi desidratado, diafanizado e embebido em parafina para obtenção dos blocos.14

Confecção das Lâminas Histológicas

Uma vez obtidos os blocos de parafina, secções coronais da calvária foram coletadas. Todas as secções tinham 6 µm de espessura. Como padrão, oito secções consecutivas dos blocos da calvária foram, primeiramente, coletadas; 2 lâminas histológicas foram preparadas e 15 secções foram, finalmente, descartadas; estes passos foram realizados repetidamente até serem obtidas 20 lâminas. Todas as lâminas foram coradas com hematoxilina e eosina e observadas ao microscópio de luz.

Análises Descritivas e Histomorfométricas

As lâminas foram fotografadas usando o programa Optica View 7 e as imagens foram registradas com ampliação de 100x para todo o defeito ósseo da calvária. Essas imagens foram analisadas por um único examinador usando o programa Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA). Os processos de reparação da calvária foram demonstrados por meio de análise descritiva. A área óssea neoformada em todo o defeito ósseo da calvária foi examinada por análise histomorfométrica. Para isso, uma régua milimétrica foi primeiramente fotografada com ampliação 100x e depois medida de ponta a ponta; a distância em pixels foi registrada; a distância conhecida foi estabelecida de acordo com o tamanho da régua (1 mm); e a unidade de comprimento foi ajustada em milímetros. Esta informação foi registrada em cada foto do defeito da calvária para definir escala. Por fim, desenhou-se uma linha marcando todo o osso recém-formado dentro do defeito da calvária e, finalmente, calculou-se a área do osso novo. Os valores quantificados foram comparados entre os grupos.

Análise Estatística

Os dados foram analisados usando o software R (R Core Team). Os testes de Bartlett e de Shapiro-Wilk foram utilizados para verificar o desvio dos pressupostos. Uma vez que a homogeneidade de variância e distribuição normal foram confirmadas, o teste de análise de variância (ANOVA, na sigla em inglês) e de Tukey foram usados para comparar os grupos do período 1 e 2, separadamente. O nível de significância foi estabelecido em 5% (p < 0,05).

 

RESULTADOS

Análise Histológica Descritiva do Defeito Ósseo da Calvária

A técnica histológica convencional utilizando microscopia de luz é amplamente utilizada para análise de reparo ósseo. Essa técnica permite uma análise descritiva do tecido e a mensuração da área dos componentes de interesse (histomorfometria).15 Utilizamos essas análises para avaliar o osso neoformado no defeito da calvária.

A análise descritiva revelou um estágio semelhante de reparo ósseo entre os grupos C1, L31 e L501 e entre os grupos C2, L32 e L502 (Figura 1). Trabéculas mineralizadas do osso recém-formado se estenderam das bordas do osso basal em direção ao centro do defeito. Observamos vários osteócitos aprisionados na matriz óssea e espaços medulares cheios de células sanguíneas ao longo das trabéculas. Numerosos osteoblastos ativos foram notados ao redor das trabéculas. Tecido conjuntivo abundante, amplamente vascularizado, preencheu as porções centrais do defeito.

Análise Histológica Histomorfométrica da Calvária

A análise histomorfométrica da calvária está representada na Figura 2. Medimos a área do osso neoformado em cada grupo. Os resultados mostraram que a quantidade de osso novo nos grupos L31 e L501 foi semelhante à do grupo C1. Da mesma forma, a quantidade de osso novo nos grupos L32 e L502 foi semelhante à do grupo C2. Esses dados são coerentes com aqueles da análise descritiva.

 

DISCUSSÃO

Este trabalho investigou o efeito sistêmico do látex de H. speciosa sobre a neoformação óssea em ratos Wistar.

Em resumo, o osso é um tecido conjuntivo mineralizado altamente dinâmico, e suas principais células (osteoblastos, osteoclastos e osteócitos) são essenciais para sua remodelação.1,2

Na presença de uma fratura, os eventos relacionados à cicatrização resultam na formação de um novo osso.16 Nos estágios iniciais da produção óssea, os osteoblastos depositam a matriz orgânica, formando um tecido conhecido como osteoide. Então, os osteoblastos liberam vesículas com reservas de Ca que são degradadas por enzimas para liberar esse íon na matriz recém-depositada. Os osteoblastos também secretam fosfatase alcalina, uma enzima que degrada o pirofosfato, liberando íons de fosfato.2,4,17 Fosfato e Ca formam cristais de hidroxiapatita e mineralizam a matriz óssea, formando o novo osso.1 No presente estudo, a análise histológica mostrou trabéculas do osso neoformado ao longo do defeito da calvária. Segundo a literatura, na presença de uma fratura, os eventos relacionados à cicatrização resultam na formação de um calo ósseo que progride para interligar as duas extremidades.16 Esses conceitos explicam porque o processo de reparo ósseo começou nas bordas do osso basal em direção ao centro do defeito da calvária em todos os grupos.

A análise histomorfométrica revelou que as administrações orais de látex a 3% e a 50% não aumentaram a área do osso neoformado no defeito da calvária, mesmo após 15 e 30 dias de tratamento. Por outro lado, a literatura confirma que há um aumento na área do osso neoformado tanto na calvária12 quanto no alvéolo mandibular8 de ratos tratados com látex natural usando aplicações locais do produto. Esse efeito pode ser atribuído à presença de alguns fitoquímicos no látex. Dos santos Neves et al12 identificaram que o látex de H. speciosa contém ácido clorogênico e naringenina-7-O-glicosídeo. Há evidências de que esses compostos estimulam as atividades osteoblásticas.18,19 Os osteoblastos ativos secretam uma grande quantidade de fosfatase alcalina e osteocalcina, moléculas importantes para a deposição de Ca e mineralização óssea (Florence et al., 2017). Assim, esses fitoquímicos podem aumentar a densidade mineral óssea e melhorar a microarquitetura óssea.18,19 Possivelmente, nossos resultados são diferentes dos encontrados na literatura por causa das distintas vias de administrações do produto. No presente estudo, avaliamos o efeito do produto administrado oralmente enquanto que os estudos descritos na literatura demonstram resultados do produto quando administrado pela via tópica. Para confirmar o efeito da administração oral do látex na neoformação óssea, outras doses precisam ser avaliadas em estudos futuros. E ainda, a composição química do osso neoformado também precisa ser analisada para entender a crença popular sobre o benefício de consumir leite de mangaba diariamente para o tratamento de fraturas.13

 

CONCLUSÃO

No presente artigo, descobrimos que administrações diárias e orais do látex de H. speciosa a 3% e a 50% durante um período de 15 e 30 dias não contribuiu para o aumento da área do osso neoformado no defeito da calvária. Para confirmar outros efeitos deste látex sobre a massa óssea, diferentes doses do produto precisam ser testadas e a composição química do osso neoformado precisa ser avaliada em estudos futuros. Dessa forma, poderemos entender a crença popular sobre o benefício de consumir leite de mangaba diariamente para o tratamento de fraturas.

 

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), número 141226/2014-5 pelo apoio dado ao presente estudo.

 

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